酶活性抑制分析法（四） 混匀后37℃反应15min以上

2、酶活丁酰胆碱酯酶活性抑制分析的性抑析法分光光度法：丁酰胆碱酯酶活性抑制法的分光光度法采用国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》(GB／T 5009.199—2003)。在试管中加入用磷酸盐缓冲液提取法提取的制分蔬菜样品提取液2.5 mL(空白对照管加2.5 mL磷酸盐缓冲液)，然后分别加人O.1mL丁酰胆碱酯酶液和0.1mL显色液(取160mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6mg NaHCO2，酶活用20mL pH 8.0的性抑析法磷酸盐缓冲液溶解)，混匀后37℃反应15min以上，制分加入0.1mL底物液(25 mg碘化硫代丁酰胆碱溶于3mL蒸馏水)混匀，酶活立即加入比色皿中，性抑析法用分光光度计在412nm波长下分别测定37℃反应3min样品吸光度的制分变化值(△As)和空白吸光度的变化值(△A0)。计算酶活性被抑制的酶活百分率，计算公式为：

当样品提取液对酶活性的性抑析法抑制率低于15％时，表示该蔬菜为安全或比较安全；抑制率为16％～25％表示该蔬菜为轻度污染；抑制率为26％～50％时为中度污染；抑制率≥50％表示样品中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。制分对明显呈阳性结果的酶活样品需要重复检测2次以上，必要时用色谱色质联用等方法进一步测定具体的性抑析法农药品种和含量。

(二)速测卡(酶片)法

速测卡由浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的制分纸片(酶片)和含酶的底物2，6-二氯靛酚乙酸酯的纸片(底物片)组成。2，6-二氯靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化下能迅速发生水解反应生成蓝色的2，6-二氯靛酚，如果酶片上存在有机磷或氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶活性受抑制，2，6-二氯靛酚乙酸酯不能被水解产生蓝色的2，6-二氯靛酚，底物片不变色，如不含农药则显蓝色，其基本技术及原理与比色法相似，检测灵敏度也相近。使用纸片这种简单的载体，可以达到便于携带和现场操作的目的，不需仪器。检测过程如图6—2所示。

每批测定应设缓冲液空白对照。酶片浸入或滴加样品提取液后应保持湿润，无论是预反应10min，还是酶片与底物片复合反应3min，反应温度最好为37℃，温度低时应适当延长反应时间。

(三)薄层光谱酶活性抑制法

含农药的样品提取液在薄层板上展开后，喷酶液至板面湿润，在37℃、相对湿度90％的恒温箱中放置20min，取出后喷显色底物液，37℃保温5min，背景呈紫红色；有农药的部位由于酶活性被抑制，不能水解底物产生紫红色的产物，板上呈现白色斑点，通过斑点面积法或薄层扫描法进行定量分析。

(四)固相酶速测技术

速测片法常会遇到酶活性和灵敏度降低，测不出超标农药的现象，有时甚至还产生假阳性。这是因为水果、蔬菜的提取物中含有很多对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用的杂质，这些杂质对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，是通过可逆性结合来实现的，然而农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用是不可逆的。因此可通过洗涤的方法把这些没有同乙酰胆碱酯酶牢固结合的杂质去除，要达到这一目的，酶的同定化必不可少。通过把乙酰胆碱酯酶固定在一种特殊的、不会和其活性部位发生反应的载体上面，这样可以通过洗涤排除杂质对酶活性的影响，从而显著提高检测灵敏度，增强酶的稳定性，便于储存。该技术的关键在于酶的固定化。用一种蛋白质模板(如明胶、血清蛋白、血红蛋白等)作为中间体，将乙酰胆碱酯酶固定在特定的支持物上(如玻璃试管等)，在固定好酶的试管中加入待测样品溶液，温育一定时间后倾去样品溶液，洗涤去除杂质，加入酶的底物和显色剂的混合液。当样品中不含农药、固定化酶具有活性时，乙酰胆碱水解产物与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应，反应液呈黄色；如果样品中存在对酶起抑制作用的农药，反应液颜色不变或显色很浅，与标准色板对照进行定量检测。

(五)乙酰胆碱酯酶传感器

乙酰胆碱酯酶传感器是一种以固定化乙酰胆碱酯酶为生物敏感部件的生物传感器。生物传感器是指由一种生物敏感部件和信号转换器紧密配合、对特定种类物质具有选择性和可逆响应的分析装置。

第一代生物传感器是将固定了生物活性物质(包括酶、抗体、活性细胞或组织、微生物等)的膜(通常为半透膜)覆被在电化学电极上而形成。第二代生物传感器是将人工合成的媒介体与生物活性物质掺和后直接吸附或共价修饰到转换器表面而形成。第三代生物传感器是将生物活性物质直接固定在电子元件(如半导体场效应晶体管)上形成，从而可以直接感知和放大界面物质的变化，从而将生物识别与信号转换结合在一起。由于生物传感器可高度自动化、微型化与集成化，在生物医学、环境监测、海洋、军事等领域具有重要的应用价值，特别适合于现场和原位监测。以乙酰胆碱酯酶为生物敏感材料的生物传感器在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留分析中具有较好的研究和开发应用价值。

将乙酰胆碱酯酶通过丙烯酰胺异丁烯酰胺化学交联固定在铱电极表面制备电位型酶传感器，由于被测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药浓度不同，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制程度的不同，使酶水解底物所产生的反应产物浓度不同，引起电极表面和内部所产生的电位差不同，由此对被测样品中的农药进行定性分析和定量分析。

采用戊二醛法将乙酰胆碱酯酶固定在由四氰基对醌二甲烷修饰的丝网印刷电极表面，研制安培型乙酰胆碱酯酶传感器，然后用含大量非还原性多糖的酶稳定剂进行处理，在4℃冰箱保存一年后其活性无显著变化。以乙酰胆碱酯酶传感器作指示电极，Ag／Agcl电极作参比电极，硫代乙酰胆碱作乙酰胆碱酯酶的底物进行电化学分析，乙酰胆碱酯酶水解产物巯基目旦碱在电极表面氧化，产生氧化电流。

有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致氧化电流减小。电流减小的程度以抑制百分率表示，其与有机磷农药浓度的对数在一定范围内呈线性关系，可得到测定工作曲线。

式中，I0为未被农药抑制的酶电极的响应电流，I为被农药抑制后的酶电极的响应电流。

将胆碱酯酶固定在压电晶体表面，制备压电晶体酶传感器，可用于对硫磷、马拉硫磷和甲基对硫磷的测定。

乙酰胆碱酯酶传感器可用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的测定。

八、酶活性抑制分析法存在的问题

酶活性抑制分析法应注意下述几个主要问题。

①酶活性抑制分析法只适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，其灵敏度有限，且有小部分农药品种对此法很不灵敏，因此对检测结果为阴性的样品，不能认为就不含有农药残留或农药残留量不超过规定标准(MRL)。

②引起酶活性抑制分析法测定误差的一个重要因素是某些样品提取物中含有干扰酶活性的杂质，从而引起测定结果的假阳性。因此对测定呈假阳性或可疑的样本，必须进行重复检测，必要时对确定为阳性的样本进一步用色谱色质联用仪等仪器分析进行确证分析。

③在生物体外许多农药是酶的弱抑制剂，选择使用适当的转化剂，使其转变为酶的强抑制剂，也是改善方法灵敏度的途径之一。

④引起酶活性抑制法测定误差的因素还有很多，诸如酶的稳定性、底物来源及浓度、反应温度、pH、反应时间等，因此酶活性抑制分析法测定的重现性和稳定性还不够理想。

为克服多因子的影响，可考虑选择适当的稳定剂和固定化酶技术提高稳定性，通过基因工程手段研究开发具有优良特性的酶。

⑤由于农药的含量不同，对酶的抑制程度不同，不同农药对酶的抑制能力也有差别，因此产生的颜色深浅程度不同，这样就需要按不同农药、不同浓度所形成颜色深浅度的不同绘制出标准色板，以便给出农药的大致含量。在对实验材料、检测方法等在比较试验的基础E，确定检测规范和标准。

⑥为了减少样品提取液中的杂质干扰，开发简便易行的样品净化技术，也是减少假阳性出现的可选方法之一。

参考资料：农药残留分析